細胞系從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統*條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。

再次培養時檢測細胞的活性。

細胞的活率應該超過90%

對于無血清培養基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移棄使用過的細胞培養基。

2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞系(看表確定正確的清洗溶液)。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動培養瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4. 當細胞*分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞系。

5. 對于無血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。